Tomat merupakan komoditas hortikultura yang dapat dimanfaatkan sebagai sayuran maupun buah segar. Sebagai sayuran, keberadaan biji dalam buah tomat tidak begitu bermasalah, namun sebagai buah segar (table fruit) dan bahan industri saus, pasta ataupun juice, keberadaan biji yang banyak pada buah tomat sangat menganggu atau kurang disenangi. Khususnya bagi industri, tahap penyaringan biji tomat akan menambah panjang proses produksi danmenambah biaya produksi. Perakitan varietas tomat tanpa biji akan menarik bagi konsumen dan industri. Buah tomat tanpa biji dapat diinduksi melalui partenokarpi buatan. Buah partenokarpi yaitu buah yang terbentuk tanpa melalui proses polinasi dan atau fertilisasi.
 |
| tomat_partenocarpy |
Partenokarpi buatan dapat meningkatkan proses pembentukan buah (fruit setting), sehingga akan meningkatkan produksi buah. Kelebihan lain, buah partenokarpi umumnya berbiji sedikit (seedless) sehingga sangat sesuai untuk buah konsumsi ataupun untuk industri yang membutuhkan bahan baku buah tomat (Pandolfini et al., 2002). Partenokarpi buatan dapat dirangsang melalui aplikasi zat pengatur tumbuh seperti auksin, giberelin, dan sitokinin (Foz et al., 1999). Namun, metode ini kurang ekonomis untuk areal pertanaman yang luas dan dapat menyebabkan malformasi pada buah serta kurang ramah lingkungan (Donzella et al., 2000). Pembentukan buah partenokarpi buatan dapat pula diinduksi melalui rekayasa genetik, yaitu dengan menginsersikan gen partenokarpi ke dalam genom tanaman (Rotino et al., 1997).
Pembentukan buah partenokarpi melalui rekayasa genetik telah berhasil dilakukan pada beberapa tanaman dengan menggunakan gen DefH9-iaaM diantaranya tomat (Ficcadenti et al., 1998), terung (Donzella et al. 2000), strawberry dan raspberry (Mezzetti et al., 2004) serta anggur (Constantini et al., 2007). Gen DefH9-iaaM merupakan gen partenokarpi yang terdiri dari gen iaaM dan promoter DefH9. Gen iaaM diisolasi dari bakteri Pseudomonas syringae pv savastanoi (Gaffiney et al., 1990) sebagai pengkode prekursor hormon auksin (IAA). Sedangkan promoter DefH9 (deficiens homologue 9) diisolasi dari bunga Antirrhinum majus. Promoter ini mengekspresikan gen iaaM spesifik pada bagian ovul dan plasenta (Ficcadenti et al., 1998), IAA akan merangsang pertumbuhan dan perkembangan buah menggantikan peran biji, sehingga tanaman dapat membentuk buah tanpa biji (Rotino et al., 1997).
Keragaan tanaman tomat transgenik partenokarpi di Fasilitas Uji Terbatas (FUT). Pola insersi suatu gen pada progeni tanaman hasil transformasi genetik dapat diketahui dengan melakukan analisis molekuler (PCR), kemudian data hasil analisis PCR tersebut digunakan untuk uji Chi-Square Test. Pola insersi suatu gen insert bisa mengikuti pola Mendelian dengan ratio 3:1 ataupun ratio 1:1. Pola insersi dengan Ratio 3:1 relatif lebih stabil dibandingkan ratio 1:1 (Rusell, 1994). Pada penelitian ini telah dilakukan analisis pola insersi gen DefH9-iaaM pada tiga galur tomat transgenik generasi kedua (T2) dan ketiga (T3).
Penelitian dilakukan di rumah kaca Fasilitas Uji Terbatas (FUT) dan laboratorium Biologi Molekuler Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB Biogen) pada tahun 2008-2009. Bahan penelitian yang digunakan adalah tanaman tomat transgenik generasi T2 dan T3 turunan dari galur OvR1#14-4, OvM2#10-1, dan OvM2#6-2 yang membawa gen DefH9-iaaM) (Pardal et al., 2007). Sebagai pembanding adalah tanaman tetua, yaitu var. oval non transgenik dan galur CL 6046 (galur unggul Balitsa). Benih tomat transgenik (T2 atau T3) ditanam dan dipelihara di dalam rumah kaca.
Setelah tanaman berumur 3-4 minggu, dilakukan analisis molekuler menggunakan teknik PCR untuk mendeteksi keberadaan gen iaaM. Jumlah sampel untuk masing-masing galur tomat transgenik T2 sebanyak 30 tanaman, sedangkan untuk galur tomat T3 sebanyak 10 sampel tanaman. Sebagai kontrol positif adalah DNA plasmid turunan pBin19 yang terdapat pada A. tumefaciens strain C.58.GV 3101 yang membawa gen DefH9-iaaM. Fragmen DNA hasil amplifikasi dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (Sambrook et al., 1989).
Hasil positif jika menghasilkan pita DNA sebesar ± 158 pb. Data hasil uji molekuler selanjutnya dianalisis pola insersinya dengan chi-square test. Hasil analisis PCR galur tomat T2 Hasil elektroforesis gel pada seluruh sampel DNA hasil PCR menunjukkan bahwa dari 30 sampel tanaman T2 galur OvR1#14-4, sebanyak 23 sampel positif memiliki insersi gen iaaM sedangkan 7 tanaman lainnya negatif. Hasil ini menunjukkan rasio antara tanaman transgenik dan nontransgenik adalah 23:7 (3:1)
Sampel dari galur OvM2#10-1 menunjukkan 14 sampel positif dan 16 sampel negatif, sedangkan galur OvM2#6-2 menunjukkan 16 sampel positif dan 14 sampel negatif . Kedua galur tersebut memiliki rasio turunan transgenik dan nontransgenik 1:1. Kedua galur tersebut belum memiliki pola insersi gen yang stabil karena gen iaaM hanya terintegrasi pada salah satu gamet, sehingga kemungkinan besar masih akan mengalami segregasi pada generasi berikutnya.
Ada kemungkinan gen iaaM tidak akan diwariskan lagi ke generasi berikutnya (menghilang). Hasil analisis PCR galur tomat T3 Hasil visualisasi fragmen DNA produk PCR pada gel agarosa dari tiga galur tomat T3 menunjukkan bahwa pita tunggal fragmen DNA berukuran + 158 pb terlihat pada lajur kontrol positif untuk ketiga galur. Kemudian dari 10 sampel DNA galur OvR1#14-4 semuanya menghasilkan pita berukuran 158 pb (positif). Sedangkan 10 sampel DNA galur OvM2#10-1 hanya 4 sampel positif dan 6 sampel negatif.
Demikian juga pada 10 sampel DNA galur OvM2#6-2, hanya 5 sampel menunjukkan hasil positif dan 5 sampel negatif. Data hasil PCR tersebut menunjukkan bahwa galur OvR1#14-4 memiliki pola insersi yang lebih baik dibandingkan dua galur lainnya. Gen iaaM pada tanaman tomat transgenik T2 yang dipilih masih diwariskan ke 10 tanaman turunannya (T3) yang diuji. Sedangkan pada galur OvM2#10-1 dan OvM2#6-2 gen iaaM dari tanaman tomat transgenik T2 yang dipilih tidak diwariskan ke semua tanaman T3 yang diuji/disampling.
Analisis Chi-Square Test galur tomat T2 Hasil perhitungan chi-square test terhadap data hasil PCR tiga galur tomat transgeni T2 disajikan pada Tabel 3. Hasil Thitung dari galur OvR1#14-4 adalah 0,044 sehingga lebih kecil dari X2tabel. Hal ini menunjukkan bahwa galur tersebut memiliki pola insersi gen iaaM yang lebih stabil karena rationya sesuai hasil persilangan dengan satu sifat beda (monohibrid) 3:1. Sedangkan dua galur lainnya,yaitu OvM2#10-1 dan OvM2#6-2 memiliki X2hitung lebih besar dari X2tabel, sehingga tidak memiliki rasio 3:1.
Analisis chi square test galur tomat T3 Hasil Thitung dari galur OvR1#14-4 dan galur OvM2#6-2 lebih kecil dari X2tabel. Hal ini menunjukkan bahwa dua galur tersebut memiliki pola insersi gen iaaM yang lebih stabil. Sedangkan galur OvM2#10-1 memiliki X2hitung lebih besar dari X2tabel, sehingga pola insersi gen iaaM kurang stabil. Menurut Russell (1994), rasio turunan yang diperoleh dari hasil penelitian dapat dianalisis menggunakan uji chi-square.
Hasil uji chi-square menggambarkan model segregasi gen pada penyilangan monohibrid yang dikemukakan oleh Mendel. Hasil uji chi-square terhadap data hasil uji molekuler tiga galur tomat transgenik menunjukkan bahwa insersi gen partenokarpi iaaM pada tanaman tomat T2 dan T3 galur OvR1#14-4 lebih stabil dari dua galur lainnya. Hal tersebut ditunjukkan dengan nilai X2 hitung dari galur OvR1#14-4 lebih kecil dari X2 tabel 3,841. Menurut Christou et al., (1992), organisme transgenik memiliki insersi transgen yang lebih stabil jika transgen tersebut terintegrasi di dalam genom dan dapat diwariskan ke generasi berikutnya dengan persentase segregasi yang rendah.
Rasio 1:1 dari tanaman tomat T2 dan T3 galur OvM2#10-1 dan OvM2#6-2 sama dengan rasio yang diperoleh Christou et al., (1992) dalam penelitian uji stabilitas dan ekspresi gen bar pada tanaman T3 padi transgenik galur 517-5. Hasil segregasi yang menyimpang tersebut diduga karena transgen hanya diwariskan oleh salah satu gamet, yaitu gamet jantan atau betina saja. Tanaman transgenik T3 umumnya belum memiliki insersi transgen yang stabil. Karena belum homosigot.
Tanaman yang menyerbuk sendiri seperti tomat, umumnya memiliki gen yang telah stabil pada T4, sedangkan pada tanaman yang menyerbuk silang (cross pollination), gen akan stabil pada T8 (Oard et al., 1996). Dari hasil penelitian ini dapat ditunjukkan bahwa, galur OvR1#14-4 generasi kedua (T2) dan ketiga (T3) masih memiliki insersi gen partenokarpi iaaM dan menunjukkan pola segregasi Mendelian 3:1 berdasarkan uji Chi-Square. Sedangkan dua event lainnya, OvM2#10-1 dan OvM2#6-2 menunjukkan pola segregasi 1:1, sehingga ada kemungkinan gen insert akan hilang (tidak diwariskan) pada generasi berikutnya. Galur tomat transgenik partenokarpi event OvR1#14-4 perlu diuji lebih lanjut untuk melihat stabilitas gen insersinya pada generasi berikutnya (T4) agar dapat diperoleh galur tomat transgenik partenokarpi yang homosigot (disarikan dari: Pardal et al., 2014. Jurnal Berita Biologi-LIPI Vol.13 No.2, hal. 173-179).
Sumber : http://biogen.litbang.pertanian.go.id/2016/05/pola-insersi-gen-partenokarpi-defh9-iaam-pada-galur-tomat-transgenik/
EmoticonEmoticon